SILAC-IP免疫共沉淀實驗

silac-ip免疫共沉淀實驗原理
在分離純化誘餌蛋白-互作蛋白復合物過程中，不可避免地會出現非特異結合蛋白，這些蛋白會一并被質譜鑒定出來，成為假陽性的互作蛋白，影響后續挑選驗證。 傳統的判斷假陽性互作蛋白方法是：用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表，扣除掉對照組鑒定到的蛋白列表，作為“互作蛋白”。但很多真實的互作蛋白，比如豐度比較高的蛋白，在對照組中也會出現，而傳統的方法就會被排除掉。
silac技術是先將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素，即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復合物分離后，混在同一管中做酶切質譜等。這樣既能鑒定到復合物蛋白，又能根據同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量，從而更準確地判斷出互作蛋白。
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silac-ip實驗技術方案
不同的實驗背景和目的需對應用不同方案，輝駿生物提供以下三種silac-ip實驗方案：
方案一：以野生型細胞株為實驗材料
1．分別用輕、重鏈氨基酸培養細胞，取等量標記好的細胞提取蛋白質；
2．提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用normal igg和抗bait蛋白的特異抗體做co-ip；
3．混合輕、重鏈co-ip產物；
4．胰酶酶切，lc-ms/ms鑒定和定量蛋白。
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方案二：以過表達誘餌蛋白的細胞株為實驗材料
1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養正常對照細胞和過表達誘餌蛋白的細胞株(帶標簽)，取等量標記好的細胞分別提取蛋白質，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做co-ip；
3. 收集co-ip后的蛋白液，胰酶酶切，lc-ms/ms鑒定和定量蛋白。
silac ip代做_silac ip外包平臺.jpg
方案三：以干擾誘餌蛋白的細胞株為實驗材料
1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養rnai 誘餌蛋白的細胞株和正常對照細胞株，取等量標記好的細胞分別提取蛋白質，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做co-ip；
3. 收集co-ip后的蛋白液，胰酶酶切，lc-ms/ms鑒定和定量蛋白。
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應用領域
應用背景
用silac結合免疫共沉淀（coip）尋找相互作用蛋白是silac在定量蛋白質組學研究基礎上的進一步應用，稱之為silac-ip技術。該技術通過質譜鑒定和分析蛋白質相對量來判斷是否是特異性結合誘餌蛋白，當實驗組與對照組中某個蛋白質量含量達到統計學的差異時，就判定這個蛋白質與誘餌蛋白質具有相互作用。
傳統方法在判斷假陽性互作蛋白時，很容易將一些在實驗組和對照組中同時出現的真實互作蛋白當做假陽性互作蛋白排除掉，silac-ip技術將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素，結合質譜分析，既能鑒定到復合物蛋白，又能根據同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量，從而更準確地判斷出互作蛋白。
相較于傳統的免疫共沉淀和pull down技術，silac-ip技術特異性強，假陽性極低，通量高，靈敏度高，能直接檢測出與bait蛋白互作的其他蛋白的相對含量；適合于可傳代細胞，尤其是易轉基因細胞。